Au début des années 1920, elle étudie l'art des ombres chinoises à l'Institut de recherches culturelles de Berlin, et s'intéresse aux arts asiatiques. Avec Carl Koch, elle imagine une technique de création de film d'animation à partir de silhouettes de papier délicatement découpées. En 1921, elle l’épouse et ils resteront ensemble jusqu’au décès de ce dernier en 1963. Dans les années 1920 et 1930, elle réalise une série de courts métrages à partir de contes de fées et de légendes, et c’est en 1926 qu’elle signe le premier film d’animation de l’histoire du cinéma : Les aventures du Prince Ahmed. Cette maîtrise du papier découpé est réalisée avec une telle virtuosité, qu’elle ne cessera d’impressionner ses contemporains. Louis Jouvet fait projeter le film à la Comédie des Champs Elysées, et Jean Renoir est sous le charme.
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En 1933 avec l’arrivée d’Hitler au pouvoir, le couple décide de quitter l’Allemagne, mais sans visa permanent ils partagent leurs temps entre l’Angleterre, Berlin, Paris et Rome. Le déclenchement de la Seconde Guerre Mondiale les oblige à limiter leurs déplacements et en 1943, ils se réfugient en Italie chez leur ami Luchino Visconti. Après la guerre, le couple adopte la nationalité Britannique, et Lotte Reiniger travaille notamment pour la BBC. En 1956, elle réalise son premier film en couleur Jack et le haricot magique. Après la mort de son époux en 1963, elle arrête le cinéma pendant une dizaine d'années, pour se consacrer au théâtre d'ombres et à l'illustration. À la fin de sa vie, elle enseigne l'animation en Europe et aux États-Unis.
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Elle décède en 1981, et les influences directes ou indirectes que ses films ont eues sur des œuvres postérieures sont importantes. Michel Ocelot bien sûr, qui reprend et rend hommage au style visuel si caractéristique de Lotte dans ses propres contes, mais aussi les Studios Disney qui à l’époque s’inspirèrent de sa technique du mouvement, notamment à travers son premier long métrage, Les aventures du Prince Ahmed. Le film fut d’ailleurs restauré et ressorti en France en 2007.
